بررسی ارزیابی سمیت گوسیپول بر دو رده مشتق از سلولهای بنیادی بافت بیضه

ارزیابی سمیت گوسیپول بر دو رده مشتق از سلولهای بنیادی بافت بیضه
فهرست مطالب
چکیده فارسی..........................................................................................................................................................................1.    
فصل اول: مقدمه............................................................................................................................................................3.
بیضه.........................................................................................................................................................................................4.
سلولهای سرتولی......................................................................................................................................................................4.
سلولهای ژرمینال......................................................................................................................................................................5.
اسپرماتوسیت اولیه....................................................................................................................................................................5.
سلولهای بنیادی ...................................................................................................................................................................... 5.
اسپرماتوگونی(گونه ای از سلولهای بنیادی در انسان).................................................................................................................8.
سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی در موش....................................................................................................................................9.
رده سلولی رده سلولی GC1-spg ..........................................................................................................................................10.
محیط کشت مناسب برای GC1-spg......................................................................................................................................10.
رده سلولی  SFTF-PI43.......................................................................................................................................................11.
محیط کشت مناسب برای  SFTF-PI43.................................................................................................................................11.
ناباروری................................................................................................................................................................................11.
ناباروری در جنس مذکر........................................................................................................................................................12.
ناباروری در جنس مونث....................................................................................................................................................... 12.
عوامل ایجاد کننده ناباروری:
الف- ژنتیکی: .......................................................................................................................................................................13.
ب- شرایط محیطی:...............................................................................................................................................................13.
تاثیر سموم بر روی باروری.....................................................................................................................................................14.
سموم گیاهی..........................................................................................................................................................................15.
گوسیپول...............................................................................................................................................................................16.
بررسی تاثیرات گوسیپول بر روی حیوانات وانسان...................................................................................................................20.
سمیت عمومی........................................................................................................................................................................20.
اثر گوسیپول بر روی حیوانات.................................................................................................................................................21.
1-  نشخوارکنندگان:
الف- گاو..............................................................................................................................................................................21.
ب- گوسفند..........................................................................................................................................................................22.
2- غیرنشخوارکنندگان:
الف- خوک..........................................................................................................................................................................22.
ب- خرگوش.........................................................................................................................................................................23.
ج- سگ................................................................................................................................................................................24.
د- ماهی.................................................................................................................................................................................24.
جدید ترین یافته ها از اثرات گوسیپول....................................................................................................................................25.
تاثیر گوسیپول بر روی انسان...................................................................................................................................................26.
کشت سلول...........................................................................................................................................................................26.
پيشينه تحقیق..........................................................................................................................................................................27.
فصل دوم: روش کار..................................................................................................................................................31.
مواد
تهیه رده های سلولی...............................................................................................................................................................32.
 شرایط نگهداری رده های سلولی...........................................................................................................................................32.
محیط کشت  RPMI-1640.................................................................................................................................................32.
سرم جنینی گاو (fbs)............................................................................................................................................................33.
Pbs......................................................................................................................................................................................33.
Penstrep.............................................................................................................................................................................34.
DMSO...............................................................................................................................................................................34.
Trypsin EDTA................................................................................................................................................................35.
Trypan Blue sain............................................................................................................................................................35.
روش کار
پاساژ سلولی...........................................................................................................................................................................36.
ساخت محیط کشت کامل......................................................................................................................................................38.
چگونگی تهیهBack up .......................................................................................................................................................39.
احیای سلول ها...................................................................................................................................................................... 39.
کاشت رده سلولی:
1- تعیین زمان دو بررابر شدن سلولی......................................................................................................................................39.
2- کاشت¬رده¬سلولی¬در پلیت 24 خانه.....................................................................................................................................41.
تهیه محلول گوسیپول.............................................................................................................................................................42.
بررسی سمیت سلولی..............................................................................................................................................................43.
تعیین سمیت گوسیپول به روش آزمون MTT........................................................................................................................43.
آزمون MTT........................................................................................................................................................................44.
بررسی سمیت با استفاده از تریپان بلو......................................................................................................................................47.
روش آماری..........................................................................................................................................................................48.
فصل سوم: یافته ها
بررسی سمیت گوسیپول در رده سلولی GC1-spg با تست MTT.........................................................................................50.
بررسی سمیت گوسیپول در رده سلولی  SFTF-pI43با تست MTT.......................................................................................52.
بررسی سمیت گوسیپول در رده سلولی  GC1-spgو  SFTF-pI43با تست تریپان بلو.............................................................55.
شمارش سلولی برای تخمین زمان دو برابر شدن .....................................................................................................................60.
 IC50گوسیپول در دو رده سلولی...........................................................................................................................................61.

فصل چهارم: .....................................................................................................................................................................62.
بحث و نتیجه گیری................................................................................................................................................................63.
فصل پنجم..........................................................................................................................................................................70.
مشکلات................................................................................................................................................................................71.
پیشنهادات..............................................................................................................................................................................72.
تقدیر وتشکر..........................................................................................................................................................................73.
منابع...................................................................................................................................................................................... 74.
چکیده انگلیسی......................................................................................................................................................................87.

 
فهرست جداول
جدول شماره 1-3 : نتايج آزمون MTT  پس از مجاورت ردههاي سلولي GC1-spg با غلظتهاي مختلف گوسیپول...............50.
جدول شماره 2-3 : مقایسه آماری سمیت گوسیپول در با گروه  کنترل  در رده سلولی GC1-SPG توسط آزمونMTT........51.
جدول شماره 3-3 :  نتايج آزمون MTT  پس از مجاورت ردههاي سلولي SFTF-pI43 با غلظتهاي مختلف گوسیپول............53.
جدول شماره4 -3 : مقایسه آماری سمیت گوسیپول  رده سلولی SFTF-pI43توسط آزمونMTT  ..............54.
جدول شماره 5-3 : میانگین درصد حیات سلول های  SFTF-PI43و  GC1-SPG پس از مجاورت با گوسیپول به روش رنگ‌آمیزی تریپان بلو............................................................................................................................................................56.
جدول شماره 6-3 : مقایسه آماری سمیت گوسیپول رده سلولی GC1-SPG با استفاده از روش رنگ آمیزی تریپان بلو....................................................................................................................................................................57.
جدول شماره 7-3 : مقایسه آماری سمیت گوسیپول با گروه کنترل در رده سلولی SFTF-pI43  با استفاده از روش رنگ آمیزی تریپان بلو...............................................................................................................................................................................59.
 
فهرست نمودارها
نمودار شماره 1-3 : درصدحیات سلولهای GC1-spg در مجاورت باغلظتهای توسط آزمون MTT.........................................52.
نمودار شماره 2-3 : در صد حیات سلولهای SFTF-PI43 در مجاورت با غلظتهای گوسیپول توسط آزمون MTT.....................55.
نمودار شماره 3-3 : در صد حیات سلولهای  GC1-spgپس از مجاورت با غلظتهای گوسیپول به روش تریپان بلو.....................58.
نمودار شماره 4-3 : درصد حیات سلولهای  SFTF-PI43 پس از مجاورت با غلضتهای گوسیپول بهروش آزمون تریپان بلو.......60.
نمودار شماره 5-3 : نحوه محاسبه زمان تقریبی دوبرابر شدن رده سلولی GC1-spg..................................................................60.
نمودار شماره 6-3 : نحوه محاسبه زمان دو برابر شدن  در رده سلولی SFTF-PI43....................................................................61.
نمودار شماره 7-3 : تعیین  IC50گوسیپول توسط آزمون MTT در دو رده سلولی....................................................................61.
 
فهرست تصاویر
تصویر شماره 1-1 : طرحی از تکثیر اسپرماتوگونی ها و  بازسازی سلولهای بنیادی در جوندگان..........................................10.
تصویر شماره 2-1 :گیاه پنبه دانه........................................................................................................................................16.
تصویر شماره 3-1 : ساختار گوسیپول.................................................................................................................................18.
تصویر شماره 1-2 : نمایی از سلولهای GS1-spg..............................................................................................................37.
تصویر شماره 2-2 : نمایی از سلولهای، SFTF-PI43 ........................................................................................................37.
تصویر شماره 3-2 : نحوه کشت سلولها در پلیتهای 24 خانه................................................................................................41.   
تصویر شماره 4-2 : پودر گوسیپول استیک اسید   .............................................................................................................43.    
تصویر شماره 5-2 : غلظتهای مختلف گوسیپول..................................................................................................................43.
تصویر شماره 6-2 : غلظتهای مختلف گوسیپول  برای انجام آزمون MTT .........................................................................46.
تصویر شماره 7-2 : اضافه شدن MTT بعد از24 ساعت به چاهکهای پلیت.........................................................................46.

چكيده
ارزیابی سمیت گوسیپول بر روی دو رده سلول های بنیادی بافت بیضه
سابقه وهدف:
گوسیپول یک ترکیب پلی فنلی استخراج شده از گیاه پنبه دانه است. در حال حاضر این گیاه به عنوان مکمل غذایی برای تغذیه نشخوار کنندگان استفاده می شود. بعضی از مطالعات حاکی از آن است که مصرف بیش از اندازه گوسیپول، باعث اختلال در فرآیند اسپرماتوژنزیس می شود. با توجه به اینکه ممکن است این ماده بر روی سلولهای ژرمینال تاثیر بگذارد، لذا در این پژوهش، به بررسی اثر آن بر روی دو رده سلول بنیادی بافت بیضه موش GC1-spg (حیوان غیرنشخوار کننده ) و بافت بیضه گوسفند SFTF-PI43 (حیوان نشخوار کننده) پرداخته شد.
روش کار:
 سلولهای GC1-spg و SFTF-PI43، در محیط کشت RPMI1640 به همراه 10%   FBSو همچنین پنی سیلین و استرپتومایسین کشت داده شدند. سپس از هر رده سلولی، تعداد 104x5 سلول در چاهک های دو پلیت 24 خانه کاشته شد. پس از تهیه محلول گوسیپول اسید استیک در 4 غلظت 25/1، 5/2، 5 و 10 میکرومولار به مدت 24ساعت با رده¬های سلولی ذکر شده مجاورت پیدا کرده و انکوبه شدند. به منظور بررسی اثر گوسیپول استیک اسید بر روی رشد سلولها، از روش  MTT asseyو همچنین جهت بررسی حیات سلولی از روش رنگ آمیزی Trypan Blue استفاده گردید. آنالیز داده¬ها توسط آزمون یک طرفه ANOVA و T-Test با استفاده از نرم افزار  SPSS انجام شد. 
یافته¬ها:
در این مطالعه،  میزان سمیت گوسیپول، در غلضتهای 5/2، 5 و 10 میکرومولار نسبت به گروه کنترل، در هر دو رده سلولی دیده شد، که از نظر آماری معنی دار بود (P<oo1). میزان سمیت گوسیپول در غلظت 25/1 میکرومولار، از نظر آماری معنی دار نبود.
نتیجه گیری:
 اثر سمیت گوسیپول استیک اسید بر روی دو رده سلولی بافت بیضه GC1-spg , SFTF-PI43))، حاکی از کاهش توانایی حیات سلولهای بنیادی در روند اسپرماتوژنزیس بوده که وابسته به دوز است.
واژه¬های¬کلیدی: گوسیپول، توکسیسیتی، GC1-spg ، SFTF-PI43 ، بافت بیضه .